Marguerite d'Amboise est la troisième et la dernière fille de Marie de Rieux et de Louis d’Amboise, vicomte de Thouars, prince de Talmont, seigneur d'Amboise, Bléré et Montrichard, comte de Guînes, Marans, de l'Île de Ré et autres lieux. Née à la fin des années 1420 ou au début des années 1430 (sa sœur aînée, Françoise, est née en 1427), ses premières années se déroulent durant la période troublée où Charles VII n’est encore que le roi de Bourges. Son père Louis est l’un des plus riches et plus puissants barons du royaume. Prenant le parti de Charles VII contre les Bourguignons, il est l’un des compagnons de Jeanne d’Arc à Orléans. Il est aussi l’allié du connétable Arthur de Richemont et participe à ses intrigues à la cour, notamment contre Georges Ier de La Trémoille, favori du roi et grand chambellan de 1427 à 1439. Celui-ci, attiré par la fortune de Jean d’Amboise – la vicomté de Thouars compte à elle seule 3 000 vassaux -, tente de marier son fils aîné Louis à Françoise, fille aînée de Jean. Le roi, toutefois, se garde d’autoriser cette union qui ne convient pas à ses projets d’alliances entre membres de la noblesse et marie Françoise à Pierre de Bretagne, afin de satisfaire sa belle-famille d’Anjou. La Trémoille ne renonce cependant pas et obtient l’appui d’Arthur de Richemont, avec qui il s’était réconcilié, pour favoriser le mariage, en 1445, de son fils avec Marguerite d’Amboise.
Il semble, dans un premier temps, que l’union avec Marguerite ne produise pas l’enrichissement escompté. A sa mort en 1472, en effet, Jean d’Amboise laisse tous ses biens au roi : les seigneuries et châteaux d’Amboise, de Château-Gontier et de Civray entrent dans le domaine royal et Louis XI donne la principauté de Talmont, avec les châtellenies d'Olonne, Curzon, Château-Gaultier (Grosbreuil) et de Bran et Brandois (Brem-sur-Mer) à son fidèle Philippe de Commynes. Mais, en 1476, Louis de La Trémoille conteste cette donation, et ses descendants obtiennent réparation en 1491 après jugement du Parlement en 1486.
Par ailleurs, en 1485, à la mort de Françoise d’Amboise, la très riche vicomté de Thouars revient également à la famille de La Trémoille. Françoise, n’ayant pas eu d’enfants, cède tous ses droits sur celle-ci à son neveu Louis II de La Trémoille.
Ainsi, grâce à Marguerite, la famille de La Trémoille, déjà riche et puissante, réussit encore à accroître ses possessions, jusqu’à devenir la plus puissante famille de Bretagne après les Rohan.
Marguerite décède en 1475 après avoir donné quatre fils et trois filles à Louis Ier de La Trémoille.